Biuretski test

kvalitativni kemijski test, ki se uporablja za dokazovanje prisotnosti peptidnih vezi
(Preusmerjeno s strani Biuretska reakcija)

Biuretski test (biuretska reakcija) ali Piotrowskijev test je kvalitativni kemijski test, ki se uporablja za dokazovanje prisotnosti peptidnih vezi, značilnih za beljakovine. V prisotnosti beljakovin bakrovi (II) ioni tvorijo rožnato obarvan kompleks.[1][2][3][4] Metoda je svoje ime dobila po snovi, ki se imenuje biuret (H2NCONHCONH2), in nastaja ob segrevanju sečnine.[5] Na Poljskem je biuretski test v čast poljskemu fiziologu Gustawu Piotrowskijevemu, ki je metodo opisal leta 1857, poznan tudi pod imenom Piotrowskijev test.[6][7] Pri reakciji se bakrovi (II) ioni vežejo z atomi peptidne vezi (skupina -CONH-).[8][9]

A footbal containing air clear mauve solution
V zgornji epruveti je vidna rožnata barva, ki nakazuje na pozitivno reakcijo biuretskega testa.

Iz osnovne različice so razvili več različic tega testa.[10] Biuretski test je najprimernejši za analiziranje tkivnih delcev, v katerih je visoka koncentracija beljakovin, saj je neobčutljiv za prisotnost prostih aminokislin (te nimajo peptidne vezi, ki se vzpostavi komaj s povezavo dveh aminokislin v dipeptid[11][8]).[9][5] Med aminokislinami je izjema histidin, ki prav tako daje pozitivno reakcijo.[12][3][7] Pogosto se testa poslužujejo v analitski biomedicini pri dokazovanju beljakovin v urinu (seču).[7][13][14]

PostopekUredi

Vodni raztopini izbranega vzorca se doda enaka prostornina 1-odstotne baze (na primer natrijevega ali kalijevega hidroksida), ki tekočino naredi alkalno[3], nakar se v tako pripravljeno raztopino kane nekaj kapljic v vodi raztopljenega bakrovega (II) sulfata (CuSO4).[15] Raztopina se zatem zmeša.[3]

Ob prisotnosti beljakovin v vzorcu (in posledično tudi peptidnih vezi) se raztopina obarva rožnato do vijolično.[15] Večja intenziteta barve pokaže na večje število kompleksov, ki so nastali s povezavami med peptidnimi vezmi in bakrom, pa tudi na večje število peptidnih vezi v vzorcu.[8][7][16] Negativna reakcije ne povzroči spremembe barve.[3]

Po nekaterih podatkih je test zanesljiv pri vsebnosti beljakovin 0,0100 – 5,00 mg/mL.[17] Za učinkovito dokazovanje peptidnih vezi z opisanimi reagenti so nujni peptidi, ki so dolgi vsaj tri aminokisline (tripeptidi) in tako vsebujejo vsaj dve peptidni vezi.[8][15][18] S takšno raztopino reagirajo tudi različni pufri (denimo amonijak)[9], ki preprečijo normalen potek testa. Učinke amonijevih in magnezijevih ionov je mogoče izničiti z uporabo večjih količin alkalij.[3][7]

Biuretski test se lahko uporablja tudi kot kvantitativna metoda, pri čemer se koncentracije beljakovin v vzorcu meri s spektrofotometričnimi analizami.[8][4][7] Metoda temelji na načelu, da je absorpcija nastalega obarvanega kompleksa sorazmerna s količino beljakovin v merjenem vzorcu.[19]

Biuretski reagentUredi

 
V osrednjem delu je viden bakrov ion, ki se povezuje z dušikovimi atomi.

Biuretski reagent vsebuje natrijev hidroksid (NaOH) ali kalijev hidroksid (KOH) in hidriran bakrov (II) sulfat, ki se jima doda tudi kalijev natrijev tartrat, namenjen stabilizaciji bakrovih ionov (pravimo, da je tako imenovan kelat[3]) in večanju njihove topnosti.[8][19][20][21] Reagent je zaradi bakrovih ionov obarvan modro (takšne barve ostane tudi vzorec, ki ima negativno reakcijo na biuretskem testu).[22]

Kemizem testaUredi

V alkalni raztopini modro obarvani bakrovi (II) ioni tvorijo kompleks s peptidnimi vezmi beljakovin. Te imajo namreč na mestu dušika neparjene elektronske pare, k reakciji pa pripomore tudi kisik vodne molekule. Zaradi tega pride do nastajanja rožnato (vijolično) obarvanega kompleksa med Cu2+ ioni in skupinami atomov peptidne vezi, C=O ter =NH.[8][7]

Ker test daje pozitivno reakcijo na vsako spojino, ki vsebuje vsaj dve karbonilni skupini (C=O), vezani na dušikov ali ogljikov atom, je treba za večjo zanesljivost izvesti tudi drugačne detekcijske metode.[22][23]

Glej tudiUredi

SkliciUredi

  1. "Definition of biuret | Dictionary.com". www.dictionary.com (angleščina). Pridobljeno dne 2021-03-11.
  2. The reaction was first observed 1833: Ferdinand Rose (1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden" (On the compounds of albumin with metal oxides), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie, vol. 104, pages 132-142, DOI: 10.1002/andp.18331040512. It was independently rediscovered in 1857 by a Polish physiologist: G. Piotrowski (1857) "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" (A new reaction of proteins and their related derivatives) Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften in Wien, mathematisch-naturwissenschaftliche Classe (Proceedings of the Imperial Academy of Philosophies in Vienna, mathematical-natural sciences section), vol. 24, pages 335-337.
  3. 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 Karki, Gaurab (2018-04-20). "Biuret test-Principle, Requirements, Reagents, Preparation, Procedure and Result". Online Biology Notes (angleščina). Pridobljeno dne 2021-05-11.
  4. 4,0 4,1 "PROTEINS | Physiological Samples" (angleščina). 2005-01-01. str. 357–375. doi:10.1016/B0-12-369397-7/00494-5. Navedi magazine zahteva |magazine= (pomoč)
  5. 5,0 5,1 "biuret test". Oxford Reference (angleščina). doi:10.1093/oi/authority.20110803095509834. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  6. Dr. G. von Piotrowski (1857). "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge". Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Classe. 24: 335-337.
  7. 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 "Biuret Test". VEDANTU (angleščina). Pridobljeno dne 2021-05-11.
  8. 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 "Biuret Test for Protein | Biochemistry". Microbe Notes (angleščina). 2020-05-04. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  9. 9,0 9,1 9,2 Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Wiley. str. 111. ISBN 978-0470087664.
  10. “Chemistry of Protein Assay” Thermo Scientific Protein Methods Library. http://www.piercenet.com
  11. "Peptide bond formation". www.mun.ca. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  12. "Reaction of histidine with the biuret reagent in the presence of oxygen". Analytical Biochemistry (angleščina). Vol. 6 no. 1. 1963-07-01. str. 1–12. doi:10.1016/0003-2697(63)90002-2. ISSN 0003-2697.
  13. Savory, John; Pu, Pin H; Sunderman, F William, Jr. (1968-12-01). "A Biuret Method for Determination of Protein in Normal Urine". Clinical Chemistry. Vol. 14 no. 12. str. 1160–1171. doi:10.1093/clinchem/14.12.1160. ISSN 0009-9147.
  14. Guobing, Xu; Lili, Jiao; Lihua, Zhu; Tiean, Xia (2001). "Application of an improved biuret method to the determination of total protein in urine and cerebrospinal fluid without concentration step by use of Hitachi 7170 auto-analyzer". Journal of Clinical Laboratory Analysis (angleščina). Vol. 15 no. 4. str. 161–164. doi:10.1002/jcla.1020. ISSN 1098-2825. PMC 6807869. PMID 11436195.CS1 vzdrževanje: PMC format (link)
  15. 15,0 15,1 15,2 Fenk, C. J.; Kaufman, N.; and Gerbig, D. G. J. Chem. Educ. 2007, 84, 1676-1678.
  16. "2.9: Proteins". Biology LibreTexts (angleščina). 2019-07-19. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  17. Janairo, G.; Linley, Marianne S.; Yap, L.; Llanos-Lazaro, Nancy; Robles, Julita C. (2015). "Determination of the sensitivity range of biuret test for undergraduate biochemistry experiments". undefined (angleščina). Pridobljeno dne 2021-05-11.
  18. "protein determination by the biuret method". www.ruf.rice.edu. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  19. 19,0 19,1 "Spectrophotometry | Biochemical Applications" (angleščina). 2019-01-01. str. 205–213. doi:10.1016/B978-0-12-409547-2.00501-1. Navedi magazine zahteva |magazine= (pomoč)
  20. "Chemical Reagents". Arhivirano iz prvotnega spletišča dne 2010-02-13. Pridobljeno dne 2010-01-30.
  21. Datta, S. P.; Leberman, R.; Rabin, B. R. (1959). "The chelation of metal ions by dipeptides and related substances. Part 5.—Cupric complexes of sarcosyl and leucyl ligands". Trans. Faraday Soc. (angleščina). 55: 2141–2151. doi:10.1039/TF9595502141. ISSN 0014-7672.
  22. 22,0 22,1 "Biuret test - Definition and Examples - Biology Online Dictionary". Biology Articles, Tutorials & Dictionary Online (angleščina). 2020-10-03. Pridobljeno dne 2021-05-11.
  23. "Organic Chemistry 3510, Proteins and Amino Acids". people.uwplatt.edu. Pridobljeno dne 2021-05-11.