Centrifugiranje: Razlika med redakcijama
Izbrisana vsebina Dodana vsebina
m [r2.6.4] robot Dodajanje: uk:Центрифугування |
m slovnica AWB |
||
Vrstica 3:
'''Centrifugiranje''' je ločevalna tehnika, ki ločuje delce s pomočjo [[centrifugalna sila|centrifugalne sile]]. Pri centrifugiranju povečamo silo, pod vplivom katere se delci usedajo. Tako se nam gostejši delci usedejo na dno epruvete, se oborijo, medtem ko preostalo raztopino imenujemo ''supernatat''. Supernatat odstranimo s pipeto ali pa enostavno odlijemo.
Hitrost centrifugiranja je definirana z radialnim pospeškom, ki deluje na delec v centrifugalnem polju. Radialni pospešek
Hitrost usedanja delcev je odvisna od velikosti, relativne molekulske mase in oblike delcev, hitrosti centrifugiranja in gostote in viskoznosti medija. Zelo pomembno je tudi razmerje med gostoto delcev, ki jih želimo ločiti in medija, saj se pregosti zmesi čas centrifugiranja zelo podaljša, oziroma celo ustavi.
Vrstica 25:
Poznamo:
* ''diferencialno preparativno centrifugiranje'', ki temelji na dejstvu, da se gostejši delci hitreje usedajo pri manjših pospeških, manjši delci pa pri večjih pospeških. Tako vzorec najprej centrifugiramo pri najmanjši hitrosti, največji delci se posedejo, ločimo supernatat od usedline in ga ponovno centrifugiramo pri večji hitrosti in postopek večkrat ponovimo pri vedno večjem pospešku., dokler se ne posedejo manjši delci. Za zagotavljanje čistosti vzorca usedlino spiramo in jo ponovno centrifugiramo pod enakimi pogoji. Vendar se moramo zavedati, da tako vsakič nekaj materiala zgubimo in zato tega ne počnemo, ko imamo majhno količino začetnega materiala.
* ''gradientno preparativno centrifugiranje'' poteka v mediju, v katerem se po plasteh spreminja gradient gostote. Pripravimo ga lahko s posebnim mešalcem, ki deluje po principu vezanih posod ali pa kar s pipeto vnesemo enake količine medija z različno gostoto. Delci sedimentirajo, dokler ni njihova gostota enaka gostoti medija. Ta del se nato odstrani in se lahko uporabi v nadaljnji analizi. Uporablja se predvsem pri ločevanju delcev, ki so približno enako veliki, a imajo različno gostoto.
* ''izopiktično centrifugiranje'' prav tako temelji na razliki v gostotah. Gradient medija se ustvari sam na podlagi ravnotežne sedimentacije nato pa se delci ustavijo tam, kjer je gostota enaka gostoti medija. Primer je ločevanje DNK, pri akteri uporabimo raztopino cezijevega klorida. Cezijev klorid uporabimo, ker ima podobno gostoto kot DNK. Zmes damo v centrifugo za več ur, pri pospešku 10^5 x g. Čez nekaj časa se ustvari gradient cezijevega klorida zaradi dveh sil – difuzijske in centrifugalne. Molekule bodo sedimentirale stran od rotorja, najbolj koncentrirano na dnu epruvete zaradi gravitacijske sile. Difuzijska sila pa nasprotuje gravitacijski in kaže proti centru rotorja. Ravnotežje teh dveh sil pa ustvari stabilen gradient raztopine cezijevega klorida. DNK se bo ločila na podlagi relativnih razmerij adenin – timin baznih parov (manjša molekulska masa) in guanin – citozin molekulska masa (večja molekulska masa). Pri dveh molekulah DNK, ki sta enako dolgi, bo imela tista z več A-T pari manjšo gostoto. Ločile se bodo tudi druge nukleinske kisline, npr. RNK je gostejša kot dodatno zvita (supercoiled) plazmidna DNK, ki je gostejša kot linearna kromosomska DNK. Tehnika je dolgotrajna in zahteva velike hitrosti.
* ''consko centrifugiranje'' je tehnika, pri kateri majhen volumen vzorca nanesemo na vrh medija in opazujemo sedimentacijo makromolekul. Najprej moramo ustvariti medij, ki ima plasti različne gostote, primerna medija sta raztopina saharoze ali raztopina cezijevega klorida. Delci bodo sedimentirali v različnih conah, glede na gostoto in obliko delcev. Pri conskem centrifugiranju so potrebne manjše hitrosti, vendar je zelo pomemben čas, saj če centrifugiranje prehitro ustavimo sedimentacija ni končana, če pa centrifugiramo predolgo časa pa pride do ko-precipitacije vseh analitov.
''Analitsko centrifugiranje'' uporabljamo za raziskovanje čistih ali skoraj čistih [[makromolekula|makromolekul]] in delcev. Na podlagi sedimentacijskih lastnosti lahko določimo nekatere fizikalne lastnosti (čistost, relativna molekulska masa, oblika molekul, …). Potrebni so veliki pospeški, ki jih dosežejo posebne analitske centrifuge – ultracentrifuge (
▲''Analitsko centrifugiranje'' uporabljamo za raziskovanje čistih ali skoraj čistih [[makromolekula|makromolekul]] in delcev. Na podlagi sedimentacijskih lastnosti lahko določimo nekatere fizikalne lastnosti (čistost, relativna molekulska masa, oblika molekul, …). Potrebni so veliki pospeški, ki jih dosežejo posebne analitske centrifuge – ultracentrifuge (ponavadi okoli 250 000 x g), za merjenje koncentracije delcev spektrometrično pa morajo tudi prepuščati svetlobo.
Analitsko centrifugiranje se uporablja predvsem za:
* ugotavljanje čistosti molekul,
* ugotavljanje relativne molekulske mase,
* raziskovanje sprememb relativnih molekulskih mas supermolekularnih kompleksov,
* detekcijo konformacijskih sprememb,
* na področju raziskave vezave ligandov.
Molekulsko maso molekule izračunamo po Svedbergovi enačbi ( Teodor Svedberg je izumitelj analitske ultracentrifuge leta 1923, ki je prav tako prej Nobelovo nagrado za svoje raziskovalno delo na področju proteinov in koloidov z analitsko ultracentrifugo):
Vrstica 62 ⟶ 61:
* v biokemičnih znanostih, kemiji in biologiji za separacijo in analizo.
* za separacijo izotopov pri izdelavi nuklearne energije in nuklearnega orožja.
* v aeronavtiki in astronavtiki se uporabljajo za test ter trening reakcije in vzdržljivosti pilotov in astronavtov ob doseganju pospeškov, ki jih dosegajo ob potovanju v vesolje.
* geotehnična centrifuga se uporablja za simulacijo fenomenov, kot so eksplozije in [[potres]]i.
=== Komercialne aplikacije ===
Vrstica 76 ⟶ 75:
* Pečar Fonović U. s sod. (2009). ''Vaje iz farmacevtske biokemije''. Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, Ljubljana.
* E.L.V. Harris in S. Angal: ''Protein purification methods, a practical approach'', Oxford University Press, 1989.
* K. Wilson in J. Walker: ''Principles and techniques of Biochemistry and Molecular Biology'', Cambridge University Press, 2005.
* C. W. W. Ng, Y. H. Wang, L. M. Zhang: ''Physical Modelling in Geotechnics: proceedings of the Sixth International Conference on Physical Modelling in Geotechnics''. Taylor & Francis, 2006.
*Harrison, Roger G., Todd, Paul, Rudge, Scott R., Petrides D.P. ''Bioseparations Science and Engineering''. Oxford University Press, 2003.
*[http://www.coleparmer.com/techinfo/techinfo.asp?htmlfile=basic-centrifugation.htm&ID=30] http://www.coleparmer.com/techinfo/techinfo.asp?htmlfile=basic-centrifugation.htm&ID=30
*[http://www.public.asu.edu/~laserweb/woodbury/classes/chm467/bioanalytical/centrifugation%20notes.html] http://www.public.asu.edu/~laserweb/woodbury/classes/chm467/bioanalytical/centrifugation%20notes.html
*Roger A. Davis and Jean E. Vance, Structure, assembly and secretion of lipoproteins, 1996, Elsevier Science B. V.
*http://www.phys.sinica.edu.tw/TIGP-NANO/Course/2007_Spring/Class%20Notes/AC_Chapter%203%20Centrifugation%200321.pdf
[[Kategorija:Laboratorij]]
| |||