Po letu 1526 je Češka prišla bolj pod habsburški nadzor, ko so Habsburžani postali najprej izvoljeni in nato leta 1627 dedni vladarji Češke. Avstrijski Habsburžani v 16. stoletju, ki so bili ustanovitelji srednjeevropske habsburške monarhije, so bili pokopani v Pragi. Med letoma 1583-1611 je bila Praga uradni sedež svetega rimskega cesarja [[Rudolf II. Habsburški|Rudolfa II.]] in njegovega dvora.
[[Praška defenestracija|Defenestracija Prage]] in kasnejši upor proti Habsburžanom leta 1618, je zaznamoval začetek [[tridesetletna vojna|tridesetletne vojne]], ki se je hitro razširila po vsej Srednji Evropi. Leta 1620 je bil upor na Češkem zatrt v [[bitka na Beli gori|bitki na Beli gori]], in so se okrepile vezi med Češko in dednimi habsburškimi deželami v Avstriji. Voditelji češkega upora so bili usmrčeni leta 1621. Protestantsko plemstvo in meščanstvo je moralo bodisi sprejeti krščanstvokatolicizem ali zapustiti državo. <ref>{{cite web|title=Protestantism in Bohemia and Moravia (Czech Republic)|url=http://www.museeprotestant.org/en/notice/protestantism-in-the-republic-of-czechoslovakia/|website=Virtual Museum of Protestantism|accessdate=25 May 2015}}</ref>
[[File:Defenestration-prague-1618.jpg|thumb| Praška defenestracija je začetek tridesetletne vojne]]
