Centrifugiranje: Razlika med redakcijama

Izbrisana vsebina Dodana vsebina
Klemen Kocjancic (pogovor | prispevki)
m slovnica AWB
Brez povzetka urejanja
Vrstica 1:
{{slog}}
 
'''Centrifugiranje''' je ločevalna tehnika, ki ločuje delce s pomočjo [[centrifugalna sila|centrifugalne sile]]. Pri centrifugiranju povečamo silo, pod vplivom katere se delci usedajo. Tako se nam gostejši delci usedejo na dno epruvete, se oborijo, medtem ko preostalo raztopino imenujemo ''supernatat[[supernatant]]''. SupernatatSupernatant odstranimo s [[pipeta|pipeto]] ali pa enostavno odlijemo.
 
Hitrost centrifugiranja je definirana z radialnim pospeškom, ki deluje na delec v centrifugalnem polju. [[Radialni pospešek]] po navadi navajamo kot število obratov na minuto ali kot mnogokratnik [[težni pospešek|gravitacijskega pospeška]] ( 1000 x g).
Hitrost usedanja delcev je odvisna od velikosti, relativne molekulske mase in oblike delcev, hitrosti centrifugiranja in gostote in viskoznosti[[viskoznost]]i medija. Zelo pomembno je tudi razmerje med gostoto delcev, ki jih želimo ločiti in medija, saj se pregosti zmesi čas centrifugiranja zelo podaljša, oziroma celo ustavi.
 
Za študij biokemičnih in fizioloških lastnosti organelov[[organel]]ov in biomolekul je pomembna ohranitev bioloških funkcij med [[separacija|separacijo]] celičnih komponent. Zato so danes centrifugalne tehnike nepogrešljivo orodje v moderni [[biokemija|biokemiji]] in [[biomedicina|biomedicini]].
 
==Centrifuga==
[[Slika:Tabletop centrifuge.jpg|thumb|right|200px|Namizna laboratorijska centrifuga]]
Centrifuga je naprava, ki jo uporabljamo za centrifugiranje. Običajno jo poganja [[elektromotor]], starejši modeli pa se poganjajo ročno. Elektromotor vrti rotorjrotor, ki je narejen iz aluminija[[aluminij]]a ali titana[[titan]]a, in vsebuje vzorce, ki jih želimo ločiti.
 
Poznamo različne tipe centrifug, ki jih delimo v 4 skupine, glede na pospeške, ki jih lahko dosežejo in količino materiala, ki ga lahko centrifugiramo:
 
* ''majhne namizne centrifuge in mikrofuge:'' do 6.000 oziroma 14.000 vrtljajev/min, za manjše količine hitro sedimentirajočega materiala (eritrociti[[eritrocit]]i, [[kvasovke]], ostanki tkiv)
* ''hlajene centrifuge z veliko kapaciteto:'' okoli 6.000 vrtljajev/min, do 6 litrov, za zbiranje hitro sedimentirajočega materiala (eritrociti, [[celično jedro|jedra]], kvasovke, kloroplasti[[kloroplast]]i)
* ''hlajene centrifuge z veliki hitrostmi:'' okoli 25.000 vrtljajev/min, za zbiranje [[mikroorganizem|mikroorganizmov]], stankovostankov celic, velikih organelov in [[beljakovina|proteinov]], oborjenih z [[amonijev sulfat|amonijevim sulfatom]]
* ''ultracentrifuge (preperativnepreparativne in analitske):'' do 80.000 vrtljajev/min; centrifugiranje poteka v vakumu[[vakuum]]u, s čemerčimer preprečimo segrevanje rotorja zaradi [[trenje|trenja]] z zrakom.
 
==Načini centrifugiranja==
V biokemičnih znanostih ločimo '''preparativno''' in '''[[analitika|analitsko]]''' centrifugiranje.
 
''Preparativno centrifugiranje'' uporabljamo za ločitev, izolacijo in čiščenje večje količine materiala za nadaljnje raziskave (npr. celice, organele, [[celična membrana|membrane]], polisome[[polisom]]e, ribosome[[ribosom]]e, [[kromatin]], [[nukleinska kislina|nukleinske kisline]], lipoproteine[[lipoprotein]]e in viruse[[virus]]e).
 
Poznamo:
* ''diferencialno preparativno centrifugiranje'', ki temelji na dejstvu, da se gostejši delci hitreje usedajo pri manjših pospeških, manjši delci pa pri večjih pospeških. Tako vzorec najprej centrifugiramo pri najmanjši hitrosti, največji delci se posedejo, ločimo supernatatsupernatant od usedline in ga ponovno centrifugiramo pri večji hitrosti in postopek večkrat ponovimo pri vedno večjem pospešku., dokler se ne posedejo manjši delci. Za zagotavljanje čistosti vzorca usedlino spiramo in jo ponovno centrifugiramo pod enakimi pogoji. Vendar se moramo zavedati, da tako vsakič nekaj materiala zgubimoizgubimo in zato tega ne počnemo, ko imamo majhno količino začetnega materiala.
 
* ''gradientno[[gradient]]no preparativno centrifugiranje'' poteka v mediju, v katerem se po plasteh spreminja gradient gostote. Pripravimo ga lahko s posebnim mešalcem, ki deluje po principu vezanih posod ali pa kar s pipeto vnesemo enake količine medija z različno gostoto. Delci sedimentirajo, dokler ni njihova gostota enaka gostoti medija. Ta del se nato odstrani in se lahko uporabi v nadaljnji analizi. Uporablja se predvsem pri ločevanju delcev, ki so približno enako veliki, a imajo različno gostoto.
 
* ''izopiktično centrifugiranje'' prav tako temelji na razliki v gostotah. Gradient medija se ustvari sam na podlagi ravnotežne [[sedimentacija|sedimentacije]] nato pa se delci ustavijo tam, kjer je gostota enaka gostoti medija. Primer je ločevanje [[deoksiribonukleinska kislina|DNK]], pri akterikateri uporabimo raztopino cezijevega klorida. [[Cezijev klorid]] uporabimo, ker ima podobno gostoto kot DNK. Zmes damo v centrifugo za več ur, pri pospešku 10^5 x g. Čez nekaj časa se ustvari gradient cezijevega klorida zaradi dveh sil – [[difuzija|difuzijske]] in centrifugalne. Molekule bodo sedimentirale stran od rotorja, najbolj koncentrirano na dnu epruvete zaradi gravitacijske sile. Difuzijska sila pa nasprotuje gravitacijski in kaže proti centru rotorja. Ravnotežje teh dveh sil pa ustvari stabilen gradient raztopine cezijevega klorida. DNK se bo ločila na podlagi relativnih razmerij [[bazni par|baznih parov]]: [[adenin]][[timin baznih parov]] (manjša molekulska masa) in guanin[[gvanin]][[citozin molekulska masa]] (večja molekulska masa). Pri dveh molekulah DNK, ki sta enako dolgi, bo imela tista z več A-T pari manjšo gostoto. Ločile se bodo tudi druge nukleinske kisline, npr. RNK je gostejša kot dodatno zvita (supercoiled) plazmidna DNK, ki je gostejša kot linearna kromosomska DNK. Tehnika je dolgotrajna in zahteva velike hitrosti.
* ''consko centrifugiranje'' je tehnika, pri kateri majhen volumen vzorca nanesemo na vrh medija in opazujemo sedimentacijo makromolekul. Najprej moramo ustvariti medij, ki ima plasti različne gostote, primerna medija sta raztopina saharoze ali raztopina cezijevega klorida. Delci bodo sedimentirali v različnih conah, glede na gostoto in obliko delcev. Pri conskem centrifugiranju so potrebne manjše hitrosti, vendar je zelo pomemben čas, saj če centrifugiranje prehitro ustavimo sedimentacija ni končana, če pa centrifugiramo predolgo časa pa pride do ko-precipitacije vseh analitov.